聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法。
在這種支持介質(zhì)上可根
據(jù)被分離物質(zhì)分子大小和分子電荷多少來分離。
聚丙烯酰胺凝膠有以下優(yōu)點：
①
聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和
N
，
N'
甲叉雙丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝膠有
格子是帶有酰胺側(cè)鏈的碳
-
碳聚合物，沒有或很少帶有離子的側(cè)基，因而電滲作用比較小，
不易和樣品相互作用。
②
由于聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的物質(zhì)，在聚合前可調(diào)節(jié)單體的濃度比，形成
不同程度交鏈結(jié)構(gòu)，其空隙度可在一個較廣的范圍內(nèi)變化，可以根據(jù)要分離物質(zhì)分子
的大小，選擇合適的凝膠成分，使之既有適宜的空隙度，又有比較好的機械性質(zhì)。一
般說來，含丙烯酰胺
7-7.5%
的凝膠，機械性能適用于分離分子量范圍不
1
萬至
100
萬物
質(zhì)，
1
萬以下的蛋白質(zhì)則采用含丙烯酰胺
15-30%
的凝膠，而分子量特別大的可采用含
丙烯酰胺
4%
的凝膠，
大孔膠易碎，
小孔膠則難從管中取出，
因此當(dāng)丙烯酰胺的濃度增
加時
可以減少雙含丙烯酰胺，以改進凝膠的機械性能。
③
在一定濃度范圍聚丙烯酰胺對熱穩(wěn)定。凝膠無色透明，易觀察，可用檢測儀直接測定。
④
丙烯酰胺是比較純的化合物，可以精制，減少污染。合成聚丙烯酰胺凝膠的原料是丙烯酰
胺和甲撐雙丙烯酰胺。丙烯酰胺稱單體，甲撐雙
丙烯酰胺稱交聯(lián)劑，在水溶液中，單體和交聯(lián)劑通過自由基引發(fā)的聚合反應(yīng)形成凝
膠。
在聚丙烯酰胺凝膠形成的反應(yīng)過程中，需要有催化劑參加，催化劑包括引發(fā)劑和
另速劑兩部分。引發(fā)劑在凝膠形成中提供始自由基，通過自由基的傳遞，使丙烯酰胺
成為自由基，發(fā)動聚合反應(yīng)，加速劑則可加快引發(fā)劑放自由基的速度。常用的引發(fā)劑
和加
速劑的配伍如下表：
聚合反應(yīng)催化劑配伍
引
發(fā)
劑
加
速
劑
（
NH4)2S2O8 TEMED
(NH4)2S2O8DMAPN
核
黃
素
TEMED
注：
(NH4)2S2O8
，過硫酸胺
TEMED
：
N
，
N
，
N
，
N';
四甲基乙二胺
DMAPN
：
β
－二甲基
胺基丙晴
用過硫酸銨引發(fā)的反應(yīng)稱化學(xué)聚合反應(yīng)；用核黃素引發(fā)，需要強光照射反應(yīng)液，
稱光聚合
反應(yīng)。
聚丙烯酰胺聚合反應(yīng)可受下列因素影響：
聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法。
在這種支持介質(zhì)上可根
據(jù)被分離物質(zhì)分子大小和分子電荷多少來分離。
聚丙烯酰胺凝膠有以下優(yōu)點：
①
聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和
N
，
N'
甲叉雙丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝膠有
格子是帶有酰胺側(cè)鏈的碳
-
碳聚合物，沒有或很少帶有離子的側(cè)基，因而電滲作用比較小，
不易和樣品相互作用。
②
由于聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的物質(zhì)，在聚合前可調(diào)節(jié)單體的濃度比，形成
不同程度交鏈結(jié)構(gòu)，其空隙度可在一個較廣的范圍內(nèi)變化，可以根據(jù)要分離物質(zhì)分子
的大小，選擇合適的凝膠成分，使之既有適宜的空隙度，又有比較好的機械性質(zhì)。一
般說來，含丙烯酰胺
7-7.5%
的凝膠，機械性能適用于分離分子量范圍不
1
萬至
100
萬物
質(zhì)，
1
萬以下的蛋白質(zhì)則采用含丙烯酰胺
15-30%
的凝膠，而分子量特別大的可采用含
丙烯酰胺
4%
的凝膠，
大孔膠易碎，
小孔膠則難從管中取出，
因此當(dāng)丙烯酰胺的濃度增
加時
可以減少雙含丙烯酰胺，以改進凝膠的機械性能。
③
在一定濃度范圍聚丙烯酰胺對熱穩(wěn)定。凝膠無色透明，易觀察，可用檢測儀直接測定。
④
丙烯酰胺是比較純的化合物，可以精制，減少污染。合成聚丙烯酰胺凝膠的原料是丙烯酰
胺和甲撐雙丙烯酰胺。丙烯酰胺稱單體，甲撐雙
丙烯酰胺稱交聯(lián)劑，在水溶液中，單體和交聯(lián)劑通過自由基引發(fā)的聚合反應(yīng)形成凝
膠。
在聚丙烯酰胺凝膠形成的反應(yīng)過程中，需要有催化劑參加，催化劑包括引發(fā)劑和
另速劑兩部分。引發(fā)劑在凝膠形成中提供始自由基，通過自由基的傳遞，使丙烯酰胺
成為自由基，發(fā)動聚合反應(yīng)，加速劑則可加快引發(fā)劑放自由基的速度。常用的引發(fā)劑
和加
速劑的配伍如下表：
聚合反應(yīng)催化劑配伍
引
發(fā)
劑
加
速
劑
（
NH4)2S2O8 TEMED
(NH4)2S2O8DMAPN
核
黃
素
TEMED
注：
(NH4)2S2O8
，過硫酸胺
TEMED
：
N
，
N
，
N
，
N';
四甲基乙二胺
DMAPN
：
β
－二甲基
胺基丙晴
用過硫酸銨引發(fā)的反應(yīng)稱化學(xué)聚合反應(yīng)；用核黃素引發(fā)，需要強光照射反應(yīng)液，
稱光聚合
反應(yīng)。
聚丙烯酰胺聚合反應(yīng)可受下列因素影響：
核
黃
素
TEMED
核
黃
素
TEMED
以下為東營光正化工有限責(zé)任公司為大家整理的聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作步驟~
1、安裝夾心式垂直板電泳槽：夾心式垂直板電泳槽兩側(cè)為有機玻璃制成的電極槽，兩電極槽中間有一凝膠模，該模由ㄩ形硅膠框，長、短玻璃板，模板梳組成，電泳槽由上貯槽(白金電極面對短玻璃板)，下貯槽(白金電極面對長玻璃板)和回紋冷凝管組成，兩電極槽與凝膠模間靠貯液槽螺絲固定，其組裝順序為：
①裝貯槽和固定螺絲銷釘；
②將洗凈的長、短玻璃板分別插到ㄩ形硅橡膠框的凹形槽中，注意不要用手接觸灌膠面的玻璃；
③將已插好玻板的凝膠模夾到貯槽中，短玻璃板應(yīng)面對上貯槽，長玻璃板應(yīng)面對下貯槽，雙手以對角線的方式旋緊螺絲帽；
④豎直電泳槽，用滴管吸取少量的1%瓊脂糖溶液，灌入凝膠模板底部(長玻璃板外側(cè)，下沿凹形小槽內(nèi))，液面高度約0.5～1.0cm,待瓊脂糖凝固后,即堵住凝膠模下面的窄縫(通電時又可作為鹽橋)。
2、配膠：根據(jù)所測蛋白質(zhì)分子量范圍，選擇適宜的分離膠濃度。
3．制備凝膠板：
（1）分離膠制備：按表配制20ml 10%分離膠，混勻后用細長頭滴管將凝膠液加至長、短玻璃板間的縫隙內(nèi)，約8cm高，用1ml注射器取少許蒸餾水，沿長玻璃板板壁緩慢注入，約3—4mm高，以進行水封。約30min后，凝膠與水封層間出現(xiàn)折射率不同的界線，則表示凝膠完全聚合。傾去水封層的蒸餾水，再用濾紙條吸去多余水分。
（2）濃縮膠的制備：按表配制10ml 3%濃縮膠，混勻后用細長頭滴管將濃縮膠加到已聚合的分離膠上方，直至距離短玻璃板上緣約0.5cm處，輕輕將樣品槽模板插入濃縮膠內(nèi)，避免帶入氣泡。約30min后凝膠聚合，再放置20—30min。待凝膠凝固，小心拔去樣品槽模板，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多余的水分，將pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液倒入上、下貯槽中，應(yīng)沒過短板約0.5cm以上，即可準備加樣。
n4．加樣
一般加樣體積為10－15μL（即2－10μg蛋白質(zhì)）。如樣品較稀，可增加加樣體積。用微量注射器小心將樣品通過緩沖液加到凝膠凹形樣品槽底部，待所有凹形樣品槽內(nèi)都加了樣品，即可開始電泳。
n5．電泳
加樣畢，在上槽加入0.1%溴酚藍數(shù)滴，不要移動電泳槽(防引起樣品漂流)，接通電源，先低壓電泳一般時間，待指示劑在膠板上成一條直線時，即可將電泳槽移入冰箱，按所需電流電壓進行電泳。溫度控制在0～4℃。由于電流和電壓同電極緩沖液的離子強度有關(guān)，因此根據(jù)電極緩沖液分高離子強度和低離子強度兩種。高離子強度電極緩沖液配方：141.1g甘氨酸加30g Tris加水1000ml，用時稀釋20倍調(diào)PH值至8.3；低離子強度電極緩沖液配方：2g甘氨酸加5.2g Tris加水至1000ml，用時衡釋10倍，調(diào)PH值至8.7。
當(dāng)電極緩沖液離子強度確定后，又有穩(wěn)定電流和穩(wěn)定電壓兩種電泳方式。用高離子強度電泳液，穩(wěn)定電流2.0～2.5mA/cm，電泳16小時左右；用低離子強度電泳液，穩(wěn)定電流0.2～0.3mA/cm，電泳16小時左右，此為穩(wěn)定電流的方法。穩(wěn)定電壓電泳方式通常是這樣：用高離子強度時，穩(wěn)定電壓10V/cm，電泳14～15小時；用低離子強度時，穩(wěn)定電壓20V/cm，約4～5小時。若指示劑移動到離下層電泳液水平面1cm處，即可關(guān)閉電源，停止電泳。
6、卸板
電泳完畢，從冰箱中取出電泳槽，吸出電極緩沖液，將膠板從電泳槽上卸下，平放在實驗臺上，用壓舌板在兩塊玻璃板的一角輕輕一撬，揭去上面長型玻璃板。用刀片在膠板一端切除一角作為標(biāo)記，而后用磨平針尖的獸醫(yī)用針頭吸取無離子水把凝膠從短型玻璃板上剝離，慢慢地把膠板沖入白瓷盤或大培養(yǎng)皿內(nèi)，即可染色與固定。
7、固定與染色
為防止凝膠柱內(nèi)已分離成分的擴散，需要進行固定。剝出的凝膠柱只要浸泡在7%乙酸或12.5%三氯乙酸的水溶液中幾分鐘就可達到蛋白帶固定的效果。也可浸泡在用7%乙酸或12.5%三氯乙酸配制的染色液中，同時進行固定和染色。如果用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離和鑒定同工酶，為了讓酶帶上進行某種顯色反應(yīng)，往往是先顯色后固定。
8、SOD鑒定
① SOD的活性染色：參照 Beauchamp 和 Fridoch 方法, 在黑暗中將電泳后的凝膠片浸泡于 2. 45×103mol/ L 氮藍四唑( NBT) 20min, 然后, 將凝膠片移入到含有 0. 028 mol/ L 四甲基乙二胺( TEMED) , 2. 8×10- 5mol/ L 核黃素和0. 036 mol/ L 磷酸緩沖液中( pH7. 8) , 浸泡 15 min. 最后將膠片浸泡在含有 0. 05 mol/ L 磷酸緩沖液中( pH7. 8) , 1×10- 4mol/ L EDTA 溶液, 并用 4×8W 日光燈照 20min 顯帶, 蒸餾水漂洗后即可照相.
② 蛋白質(zhì)的常染色法：
考馬斯亮蘭G250
固定液
染料
染色時間
脫色
6%乙酸
6%乙酸中1%G250
10分鐘(室溫)
甲醇-水-濃氨
12.5%三氯乙酸
12.5%三氯乙酸中0.1%G250
30分鐘(室溫)
64:36:1
希望上述內(nèi)容對您有一定的幫助，如果您想了解更多關(guān)于聚丙烯酰胺的知識，歡迎繼續(xù)關(guān)注本站。
